HPLC色谱分离柱主要技术指标及有关问题的探讨

　　熊猫体育网站本文讨论了HPLC色谱分离柱的主要性能技术指标及核壳柱的有关问题.同时，对与HPLC仪器和应用有关的几个问题进行了讨论。

　　色谱分离柱是高效液相色谱(HPLC)分离过程中的核心，必须引起HPLC色谱工作者的高度重视。目前国内外已经有不少厂商正在专门研发、生产各种不同类型的HPLC色谱柱。有些HPLC仪器的生产厂商，也在研发、生产HPLC色谱柱，与自己生产的高压恒流泵、检测器组成HPLC系统销售。由于HPLC具有高速度、高分离效率、高灵敏度等优点，所以其仪器和应用发展很快

　　，对HPLC分离柱(包括填料)的研发、制造和使用，都有很高的要求、很大的难度。本文根据仪器学理论、分析检测实践的要求，和作者长期研发HPLC仪器、使用HPLC仪器和色谱柱的经验和教训，重点讨论HPLC分离柱及其有关问题，供有关科技工作者参考。2、色谱柱的主要技术指标

　　HPLC色谱分离柱的核心是填料和几何尺寸，它们都直接影响柱效;例如柱的几何尺寸，直接影响柱效。对使用者来说几何尺寸也非常重要。它包括：柱长、柱子内径、填料颗粒大小(直径)、柱填充密度和均匀性等等。几何尺寸种类繁多，数值各异，因篇幅所限，此不赘述。

　　2.2.1 理论塔板数(柱效)理论塔板数(柱效)是衡量色谱柱分离效率高低的指标，使用者希望HPLC的色谱柱分离效率高者好，所以，理论塔板数高者为好。

　　分离度是HPLC色谱柱一个非常重要的技术指标。也是一个容易被生产者、研发者、使用者忽视的指标。分离度通常被定义为：相邻组分色谱峰保留值(时间)之差△t与色谱峰平均峰底(w1+w2)/2之比。常用R表示。

　　分离度的图解如下所述：图中tR1、tR2为保留时间;w1、w1为峰底宽。

　　分离度R等于1时，两个色谱峰得到基本分离；R等于1.5时，两峰得到完全(基线)分离。在定量分析中，要对色谱峰进行积分时，最少要达到R为1，如果达到R>

　　1.5，就可以保证积分中基本没有误差。

　　分离度方程式描述了分离度与选择因子、柱效和容量因子之间的关系;它是评价一张色谱图以及如何解决、开发和优化分离方法的依据。所以，分离度是一个非常重要的性能技术指标。

　　1956年，Van Deemter提出，样品峰在色谱柱内的展宽原因如如下所述：

　　有关HPLC色谱分离柱的发展非常快，开展HPLC色谱分离柱研发的单位也很多，本文只是简单介绍我国的几种具有领先水平的色谱柱，供大家参考。因篇幅所限，本文不能一一列举，希望大家谅解。1)苏州纳微公司的UniSilTM5-120 C18,4.6 × 250mm柱

　　由于纳微科技色谱填料具有完美的球形和高度的粒径均一性，所以，具有装柱容易、反压低、柱效高、柱床稳定、分辨率高、流速均匀、柱通透性好等优点。下图说明纳微UniSilTM 5-120 C18色谱柱的分离效果好。

　　它的硅胶颗粒粒径是2.7μm，它是由1.7μm直径的实心核与0.5μm厚的多孔层所构成的。这种核壳型的硅胶颗粒提供了较短的传质路径，减少了轴向扩散，而实心核硅胶提供坚固的支撑结构，可以承受高压，具有与1.8 μm 填料相似的分离效率，且柱反压只有sub-2μm色谱柱的50%和明显的抗污染性能。由于实心核的存在，以及薄的多孔层，使得样品分子的扩散距离减小，即可以使用更高的流动相流速，极大的提高了分析速度。目前月旭已经有Boltimate®C18、Boltimate

　　核壳柱的出现，是近几十年来，HPLC的重大突破之一，值得特别重视。目前月旭、纳微、福立等正在研发、生产不同类型的核壳柱，下面对核壳柱的主要优点简单介绍之。(1)核壳柱耐压性好、反压低

　　大多数HPLC系统最高限压是6000 psi(400 bar)或更低。当填料粒径减小，反压会明显升高，使用亚2 微米的粒径填充的色谱柱时，常常在超过6000 psi时，才可获得最佳流速，这就需要购买更昂贵的“超高压”设备才能获得最佳分离性能。与3.5微米粒径填料相比，尽管核壳柱也会产生稍高的反压，但它仍能用于大多数普通的HPLC设备。

　　同样长度的色谱柱，核壳色谱柱的理论塔板数约是3.5 µm颗粒色谱柱的2倍，是5 µm颗粒的色谱柱的3倍。

　　图中显示了在HALO Peptide ES-C18柱上多肽的快速分离，9种多肽和2种蛋白质在60秒内都获得了极好的分离度。

　　主要是柱子短、填料颗粒均匀、核壳型结构等原因使流动相流径短，从而节省了大量溶剂。

　　5.1 要充分认识科学仪器的重要性、要重视仪器学理论早在100多年前，著名科学家门捷列夫(1834-1907)就曾说过：“没有测量，就没有科学”。科学仪器是测量的最基本、最重要的工具。科学仪器的创新将会引发科学技术的重大突破，带动社会经济的重大变革和进步。

　　在国计民生中，科学仪器已显示出非常重要的作用，可以说科学仪器已经起到了以下作用：工业生产的“倍增器”、科学研究的“先行官”、军事上的“战斗力”、 国民活动中的“物化法官”等等的关键作用。所以广大科学仪器研发者、生产者、使用者都应该真正认识到科学仪器的重要性。然而，目前，我国的广大科技工作者中，还有很多人，虽说每天都在使用科学仪器，但是对仪器的认识还是有不少差距;例如：自己使用的HPLC仪器有哪些最重要的技术指标、哪些技术指标对分析误差会产生很大的影响。如何评价选择分析仪器、如何选择HPLC仪器的分析测试条件、如何保证分析误差最小、如何得到最佳分析检测数据等等，很多HPLC仪器使用者还是没有搞清楚或还没有真正完全搞清楚这些问题。其实，这些问题，从仪器学理论中，都能全面的、清楚的找到答案。仪器学理论是一门涉及到光学、机械学、电子学、计算机、使用等等各个方面的学科。它是一把金钥匙，可以使你一通百通、可以使你研发生产出可靠性好的优质仪器，可以保证你把仪器用到最佳状态，保证得到最佳分析检测数据。所以，这些问题，必须引起广大从事科学仪器研发、应用的科技工作者们重视。

　　从仪器学理论和分析检测工作的实际要求着眼，研发生产HPLC分离柱及其填料的厂商，应该从整体出发，同时研发、生产HPLC的恒流泵和有关检测器，以提高我国HPLC仪器整体(系统)的水平。目前很多研发、使用HPLC的科技工作者，没有搞清楚或没有完全搞清楚HPLC中的泵、柱、检测器三者的关系。目前，国内外很多生产厂商只是生产泵、检测器，色谱柱子大多都是外购件。我们说HPLC是一个系统，是指泵、柱、检测器三者组成的一个完整的系统。如果只生产泵、检测器，就不能说是生产完整的HPLC仪器，只是生产了HPLC的两种部件，再买一根色谱柱组装成一整仪器后出售。所以，这样生产的HPLC系统，到了用户那里，总是不好用或者不大好用。而广大使用者，由于没有将HPLC的泵、柱、检测器三者互相影响的关系搞清楚，所以很多使用者不能将HPLC用到最佳水平、不能得到误差最小的最佳分析检测数据。从仪器学理论和本人长期的研发和使用HPLC的实践经验来看，作者认为HPLC的研发、使用者，应该特别重视处理好以下几个问题：(1) HPLC是一个系统，必须将到泵、柱、检测器三者(三个部件)结合起来才能叫HPLC仪器。只有三者分别都合格，三者联机后也合格，才能说这台HPLC合格。三个部件有一个不合格，联机后的整机系统肯定不合格。即使三个部件都合格，联机后，也不一定合格。只有泵、柱、测器三者质量都合格，并且联机后整机检测结果也合格，才能说明这台HPLC仪器是合格的。

　　(2)本人长期使用过HPLC，也研发HPLC仪器，实践使本人深深认识到：必须将三个部件联接起来检验测试，并能达到质量指标要求，才能说这台HPLC达到了质量要求。否则，只能说是部件合格，而整机系统不一定能合格。为什么?因为：

　　②柱对泵影响很大：柱堵塞、柱沾污、柱接头漏液等，都会影响泵的压力波动、使流速不稳定，会影响系统不稳，使RSD变坏、峰拖尾、灵敏度降低;

　　③柱对检测器影响很大：柱效降低(柱塔板数降低)、柱堵塞、柱的新旧程度、接头、管道漏液等，都会影响检测器的检测限、分辨率、噪声、和灵敏度。

　　但是，色谱柱是易损件，用户会经常在色谱柱长时间使用后换新柱，此时HPLC系统的泵和检测器基本进入“电子元件失效理论”的盆底，比较稳定了。所以，不会因为换新柱而产生仪器不能使用的问题。特别应该指出的是：用户换新柱后，一般不检测系统的综合指标。如果检测指标，可能就不能达到原出厂指标(因为泵和检测器经过较长期使用后，质量会有所下降，旧泵、新柱、旧检测器三者不能达到最佳配备)，但是不会影响使用。

　　用户换新柱不会影响使用的问题，可以从计量认证标准规范(JJG)得到佐证。JJG检验的仪器，很多是在用仪器，它明确规定被检仪器的指标可以比新出厂的仪器指标低，甚至有些指标因为达不到要求而免检。但我们的制造企业，在仪器出厂前，必须检测系统的指标，只有系统指标达到设计要求时，才算合格，才能出厂。至于用户换新检测器、换新泵、同样都是允许的。

　　④检测器更是直接影响分析测试数据可靠性的关键部件之一，研发者、生产者、使用者都必须高度重视之，才能得到优质的HPLC系统。

　　5.3 核壳柱是新型色谱柱，是HPLC技术的最重大的突破。如前所述，核壳柱有很多优点或特点，它是保证高分离效率、保证HPLC高灵敏度、保证高速度的关键所在。并且，它有很多潜力可挖。所以，我们应该花大力气去研究核壳柱及新型的色谱柱。

　　[1]李昌厚，高效液相色谱仪器及其应用，北京：科学出版社，2014.[2]李昌厚，高效液相色谱仪器及其最新进展和有关问题，2019年，仪器信息网.，2019-11-07.

　　[3]闫超，液相色谱及其应用的最新进展，“我国科学器自主创新发展”论坛，2012年8月23日，上海。

　　[5]李昌厚，用好HPLC的九大关键问题，仪器信息网，2020/2/26.

　　李昌厚，男，中国科学院上海生物工程研究中心原仪器分析室主任、兼生命科学仪器及其应用研究室主任、教授、博士生导师、华东理工大学兼职教授，终身享受国务院政府特殊津贴。主要研究方向：长期从事分析仪器研究开发和分析仪器应用研究。主要从事光谱仪器(紫外吸收光谱、原子吸收光谱、旋光光谱、分子荧光光谱、原子荧光、拉曼光谱等)、色谱仪器(液相色谱、气相色谱等)及其应用研究;特别对《仪器学理论》和分析仪器招标检测等有精深研究;以第一完成者身份，完成科研成果15项。由中科院组织专家鉴定，其中13项达到鉴定时国际上同类仪器的先进水平，2项填补国内空白;以第一完成者身份获得国家级和省部级科技成果奖5项(含国家发明奖1项);发表论文183篇，出版专著5本;现任中国仪器仪表学会理事、《生命科学仪器》副主编;曾任中国仪器仪表学会分析仪器分会第五届、第六届副理事长;国家认监委计量认证/审查认可国家级常任评审员、国家科技部“十五”、“十一五”、“十二五”和“十三五”重大仪器及其应用专项的技术专家组成员或组长、上海市科学仪器专家组成员、《光学仪器》副主编、《光谱仪器与分析》副主编、上海化工研院院士专家工作站成员等十多个学术团体和专家委员会成员等职务。

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